Determinação de flavanóis e procianidinas de cacau (DP1-7): o método oficial da AOAC

Os flavonóides e procianidinas (FCs) do cacau são um grupo de flavonóides amplamente reconhecidos pelos seus potenciais benefícios para a saúde, despertando um interesse significativo por parte dos consumidores, da indústria e dos investigadores. Métodos precisos e confiáveis ​​para quantificar estes compostos distintos em produtos à base de cacau são essenciais para fins científicos e comerciais.

A abordagem mais rigorosamente validada para medir flavanóis e procianidinas de cacau (até o Grau de Polimerização, DP1-7) é o Método Oficial de Análise 2020.05 da AOAC.

A Metodologia Central: HILIC-HPLC com Detecção de Fluorescência

O Método AOAC 2020.05 utiliza Cromatografia de Interação Hidrofílica (HILIC) acoplada à Detecção de Fluorescência (FLD) para obter resultados precisos e reprodutíveis.

1. Preparação de Amostras (Extração)

A preparação da amostra é adaptada à matriz do cacau:

• Remoção de lipídios (desengorduramento): Para amostras que contenham mais de 10% de gordura, como chocolates, licores de cacau e cacau em pó, o material é primeiro extraído com hexano para remover os componentes lipídicos.

• Extração de flavanol: Os flavanóis e procianidinas (DP 1-7) são então extraídos do material desengordurado (ou diretamente dos extratos de cacau) usando um sistema solvente aquoso acidificado de acetona, conhecido como AWAA (acetona-água-ácido acético). A mistura é agitada em vórtex e sonicada num banho a 50°C, seguida de centrifugação.

• Limpeza (SPE): A menos que seja desnecessário para a matriz específica (como extrato de cacau), a solução de extração é limpa usando um cartucho MCX PRIME de Extração em Fase Sólida (SPE). Esta etapa é crucial para eliminar componentes da matriz que poderiam acumular-se na coluna e prejudicar o desempenho analítico.

2. Cromatografia (HILIC) e Detecção (FLD)

• Sistema de Cromatografia: A análise é realizada utilizando um sistema HPLC com compartimento de coluna termostatizado e amostrador automático. A coluna necessária é uma Torus Diol (100*3,0mm id, tamanho de partícula de 1,7μm).

• Fase Móvel: É utilizado um gradiente binário, consistindo em Solvente A (ácido acetonitrila-acético) e Solvente B (metanol-água-ácido acético).

• Detecção de fluorescência: Flavanóis e procianidinas são detectados usando um FLD com comprimento de onda de excitação de 230 nm e comprimento de onda de emissão de 321 nm. Crucialmente, a configuração de ganho do tubo fotomultiplicador (PMT) deve ser otimizada para garantir a linearidade dos monômeros (DP1), mantendo a sensibilidade para oligômeros mais elevados (até DP7).

3. Quantificação e Cálculo

• Calibração: O método utiliza o material de referência de extrato de cacau NIST RM 8403 como calibrante. Sete curvas padrão separadas são traçadas para DP1 a DP7.

• Integração: Uma abordagem de integração vale a vale é usada para quantificar os picos DP individuais (DP1-7).

• CF total: O teor total de flavanol do cacau (CF total) é calculado como a soma dos _{valores individuais de CF} DPn .

Validação e Desempenho do Método

O estudo colaborativo validou a precisão do Método AOAC 2020.05 testando sete matrizes de cacau diferentes, com teor total de CF variando de 1,0 a 500 mg/g.

• Repetibilidade (RSD _r ): O desvio padrão relativo para repetibilidade variou de 1,6 a 4,8%. Isto demonstra excelente consistência dentro do laboratório e atende às expectativas de desempenho definidas pela AOAC.

• Reprodutibilidade (RSD _R ): O desvio padrão relativo para reprodutibilidade variou de 5,8 a 22,4%.

• os valores ficaram geralmente abaixo de 10% para a maioria das matrizes, demonstrando boa precisão em diferentes laboratórios.

• O desempenho atendeu à expectativa alvo de RSD _R <8% para quatro matrizes (cacau em pó, extrato de cacau, suplemento dietético em pó pronto para misturar e chocolate para panificação).

• Nota sobre Chocolate ao Leite: A reprodutibilidade do chocolate ao leite foi de 22,4%. Este pior desempenho é atribuído à concentração muito baixa de CF (em torno de 1 mg/g) encontrada nesta matriz.

Recomendação: Com base nos resultados, recomenda-se limitar a aplicação do Método AOAC 2020.05 a produtos com fração mássica de flavonóis de cacau acima de 5mg/g.

Este estudo colaborativo bem-sucedido apoia o avanço do Método Oficial de Análise 2020.05 da AOAC para o status de Ação Final para as matrizes avaliadas, solidificando seu papel como método oficial para determinação de flavanóis e procianidinas de cacau.